Protocolos (Abril 2020)

O uso do labirinto em cruz elevado como um ensaio do comportamento relacionado à ansiedade em roedores

O uso do labirinto em cruz elevado como um ensaio do comportamento relacionado à ansiedade em roedores

Resumo O labirinto em cruz elevado é um ensaio comportamental amplamente utilizado para roedores e foi validado para avaliar os efeitos anti-ansiedade dos agentes farmacológicos e hormonas esteróides e para definir as regiões do cérebro e os mecanismos subjacentes ao comportamento relacionado com a ansiedade. Res

Geração de uma população definida e uniforme de progenitores e neurônios do SNC a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Geração de uma população definida e uniforme de progenitores e neurônios do SNC a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Resumo Um protocolo detalhado é descrito permitindo a geração de populações essencialmente puras de neurônios glutamatérgicos de células estaminais embrionárias de camundongo (ES). Baseia-se na cultura de células ES que são mantidas indiferenciadas por divisão repetida e subsequentemente amplificadas como agregados celulares não aderentes. O tratament

Corrigendum: Um protocolo padronizado para estresse social repetido em camundongos

Corrigendum: Um protocolo padronizado para estresse social repetido em camundongos

O artigo original foi publicado em 21 de julho de 2011 Nat. Protoc. 6 , 1183-1191 (2011); doi: 10.1038 / nprot.2011.361; publicado online em 21 de julho de 2011; corrigido após impressão 17 December 2014 Na versão deste artigo inicialmente publicada, houve alguma confusão sobre a interpretação da sentença: “Além disso, as derrotas devem ser executadas sob constante avaliação veterinária e com a aprovação completa de todos os comitês e padrões de revisão institucional necessários.” Para maior clare

Ensaio de citometria de micronúcleo em bloco de citocinese

Ensaio de citometria de micronúcleo em bloco de citocinese

Este artigo foi atualizado Resumo O ensaio de citônquios em micronúcleos em bloco de citocinese é um sistema abrangente para medir danos no DNA, citostase e citotoxicidade. Os eventos de dano ao DNA são pontuados especificamente em células binucleadas (BN) uma vez divididas e incluem (a) micronúcleos (MNi), um biomarcador de quebra cromossômica e / ou perda cromossômica total, (b) pontes nucleoplásmicas (NPBs), um biomarcador de DNA falhas finais e / ou fusões finais de telómeros e (c) gemas nucleares (NBUDs), um biomarcador de eliminação de complexos de DNA amplificados e / ou de reparação de

Incorporação específica de sítio de fluorotirosinas na subunidade R2 da ribonucleotídeo redutase de E. coli por ligação proteica expressa

Incorporação específica de sítio de fluorotirosinas na subunidade R2 da ribonucleotídeo redutase de E. coli por ligação proteica expressa

Resumo A ligao proteica expressa (EPL) permite semi-stese de uma protea alvo com incorporao especica do local de sondas ou aminoidos n naturais nos seus terminais N ou C. Aqui, descrevemos o protocolo que o nosso laboratório desenvolveu para a incorporação de fluorotirosinas (Fn Ys) no resíduo 356 da subunidade pequena da ribonucleotídeo redutase de Escherichia coli usando EPL. Nes

Corrigendum: Análise do número de cópias em todo o genoma de células individuais

Corrigendum: Análise do número de cópias em todo o genoma de células individuais

Artigo original publicado em 03 de maio de 2012 Nat. Protoc. 7 , 1024-1041 (2012); publicado online em 3 de maio de 2012; corrigido após a impressão 24 de fevereiro de 2016 Na versão deste artigo publicado inicialmente, as unidades para a concentração de NaCl no buffer NST descritas na seção Configuração do reagente estavam incorretas. A unida

Um ensaio de micronúcleos in vivo de alto rendimento para triagem de instabilidade do genoma em camundongos

Um ensaio de micronúcleos in vivo de alto rendimento para triagem de instabilidade do genoma em camundongos

assuntos Danos no DNA e reparo Citometria de fluxo Instabilidade genômica Rato Resumo Descrevemos um método sensível, robusto e de alto rendimento para quantificar a formação de micronúcleos, marcadores de instabilidade do genoma, em eritrócitos de camundongos. Os micronúcleos são cromossomos inteiros ou segmentos cromossômicos que foram separados do núcleo. Outros mé

Triagem de atividade de substrato (SAS): um procedimento geral para a preparação e seleção de uma biblioteca de substrato de protease não peptídica baseada em fragmentos para a descoberta de inibidores

Triagem de atividade de substrato (SAS): um procedimento geral para a preparação e seleção de uma biblioteca de substrato de protease não peptídica baseada em fragmentos para a descoberta de inibidores

Resumo O rastreio de actividade de substrato (SAS) é um método baseado em fragmentos para o rápido desenvolvimento de novos substratos e a sua conversão em inibidores não peptídicos de proteases de Cys e Ser. O método consiste em três etapas: (i) uma biblioteca de N- acil-aminocumarinas com diversos grupos N- acilo de baixo peso molecular é pesquisada para identificar substratos de protease utilizando um ensaio simples baseado em fluorescência; (ii) os substratos de N- acilaminocumarina identificados são otimizados por síntese e avaliação analógicas rápidas; e (iii) os substratos otimizados são

Cultura primária de células cromafinsas bovinas

Cultura primária de células cromafinsas bovinas

Resumo Este protocolo descreve a cultura primária de células cromafins individuais derivadas da digestão enzimática da medula supra-renal da glândula adrenal bovina. Desde o final dos anos 1970, essas células forneceram um sistema modelo útil para estudar a biossíntese, armazenamento e liberação de neurotransmissores no sistema catecolaminérgico. O protoco

Ensaios baseados em biossensores para PQS, HHQ e moléculas sinalizadoras de quorum com detecção de quórum de 2-alquil-4-quinolona

Ensaios baseados em biossensores para PQS, HHQ e moléculas sinalizadoras de quorum com detecção de quórum de 2-alquil-4-quinolona

Resumo As 2-alquil-4-quinolonas (AHQs) tais como 2-heptil-3-hidroxi-4-quinolona (PQS) e 2-heptil-4-quinolona (HHQ) são moléculas sinalizadoras de quórum. Aqui, descrevemos métodos para detecção de AHQ, identificação tentativa e quantificação, que empregam uma cepa do biossensor AHQ de Pseudomonas aeruginosa baseada em lux . O protoc

Análise quantitativa de ensaios de captura de conformação cromossômica (3C-qPCR)

Análise quantitativa de ensaios de captura de conformação cromossômica (3C-qPCR)

Resumo A tecnologia de captura de conformação de cromossomos (3C) é uma metodologia pioneira que permite que a organização genômica in vivo seja explorada em uma escala que abrange algumas dezenas a algumas centenas de pares de quilobases. Entender o enrolamento do genoma nessa escala é particularmente importante em mamíferos, onde elementos reguladores dispersos, como intensificadores ou isoladores, estão envolvidos na regulação gênica. A tecnolog

Geração de extratos livres de células de ovos de Xenopus e cromatina de esperma para a montagem e isolamento de núcleos formados in vitro para Western blotting e microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Geração de extratos livres de células de ovos de Xenopus e cromatina de esperma para a montagem e isolamento de núcleos formados in vitro para Western blotting e microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Resumo Este protocolo detalha os métodos para a geração de extratos livres de células e moldes de DNA dos ovos e da cromatina espermática, respectivamente, do sapo com garras Xenopus laevis . Utilizamos este sistema com microscopia eletrônica de varredura (SEM), como detalhado aqui, para analisar os requisitos bioquímicos e as vias estruturais para a biogênese de envelopes nucleares eucarióticos (NEs) e complexos de poros nucleares (NPCs). Este pr

Obtenção de genomas de microrganismos ambientais não cultivados usando genômica unicelular baseada em FACS

Obtenção de genomas de microrganismos ambientais não cultivados usando genômica unicelular baseada em FACS

assuntos Microbiologia Ambiental Citometria de fluxo Genômica Amplificação do genoma inteiro Resumo A genômica unicelular é uma ferramenta poderosa para explorar a composição genética de microorganismos ambientais, a grande maioria dos quais é difícil, se não impossível, cultivar com as abordagens atuais. Aqui nós a

Artrite induzida por colágeno

Artrite induzida por colágeno

Resumo O modelo de rato com artrite induzida por colagénio (CIA) é o modelo auto-imune mais vulgarmente estudado da artrite reumatóide. A artrite auto-imune é induzida neste modelo por imunização com uma emulsão de adjuvante completo de Freund e colágeno tipo II (CII). Este protocolo descreve as etapas necessárias para aquisição, manuseio e preparação de CII, bem como seleção de cepas de camundongos, técnica de imunização adequada e avaliação da incidência e gravidade da artrite. Tipicamente, os pri

Geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

assuntos Desenvolvimento do sistema nervoso Neurogênese Modelos neurológicos Diferenciação de células-tronco Resumo O desenvolvimento do cérebro humano exibe vários aspectos únicos, tais como aumento da complexidade e expansão da produção neuronal, que se mostraram difíceis de estudar em organismos modelo. Como resul

Errata: Análise de partículas amarradas de DNA circular superenrolado usando alças de ácido nucléico peptídico

Errata: Análise de partículas amarradas de DNA circular superenrolado usando alças de ácido nucléico peptídico

O artigo original foi publicado em 21 de agosto de 2014 Nat. Protoc. 9 , 2206-2223 (2014); doi: 10.1038 / nprot.2014.152; publicado online em 21 de agosto de 2014; corrigido após a impressão 12 de setembro de 2014 Na versão deste artigo inicialmente publicada, a fonte da qual as Figuras 2, 4, 8 e 9 foram adaptadas não foi citada e creditada corretamente. O

Análise abrangente de fagócitos mononucleares da retina de rato

Análise abrangente de fagócitos mononucleares da retina de rato

assuntos Neuroimunologia Retina Resumo O sistema imunológico inato é ativado em vários distúrbios degenerativos e inflamatórios da retina, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). A microglia da retina, os macrófagos coroidais e os monócitos recrutados, chamados coletivamente de "fagócitos mononucleares da retina", são determinantes críticos do resultado da doença ocular. Muitas publi

Desenvolvimento, validação e implementação de testes de rastreio de alto rendimento baseados em fosfatase de metais imobilizados (IMAP) para bibliotecas de compostos de baixo peso molecular

Desenvolvimento, validação e implementação de testes de rastreio de alto rendimento baseados em fosfatase de metais imobilizados (IMAP) para bibliotecas de compostos de baixo peso molecular

Resumo Este protocolo descreve o desenvolvimento de ensaios, validação e implementação de afinidade de metais imobilizados automatizados para ensaios de triagem de fluorescência de alta resolução de transferência de tempo (TR-FRET) e testes de tempo de triagem de fluorescência de tempo resolvido (TR-FRET) para identificação de inibidores de quinase de baixo peso molecular. Ambos os

Corrigendum: nanocatalisadores à base de cobalto para processos de oxidação e hidrogenação verde

Corrigendum: nanocatalisadores à base de cobalto para processos de oxidação e hidrogenação verde

O artigo original foi publicado em 21 de maio de 2015 Nat. Protoc. 10 , 916-926 (2015); publicado online em 21 de maio de 2015; corrigido após a impressão 16 de setembro de 2015 Na versão deste artigo publicado inicialmente, o Box 1 tinha o título incorreto; o título correto é 'Experiências de reciclagem de catalisador com nitrobenzeno: 30 h'. O err