Sinalização intestinal da insulina codifica dois mecanismos moleculares diferentes para a longevidade encurtada induzida pelo óxido de grafeno em caenorhabditis elegans | relatórios científicos

Sinalização intestinal da insulina codifica dois mecanismos moleculares diferentes para a longevidade encurtada induzida pelo óxido de grafeno em caenorhabditis elegans | relatórios científicos

Anonim

assuntos

  • Ecotoxicologia
  • Toxicologia médica

Resumo

O óxido de grafeno (GO) demonstrou causar múltiplas toxicidades em vários organismos. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes para a longevidade encurtada induzida por GO ainda não estão claros. Nós empregamos Caenorhabditis elegans para investigar o possível envolvimento da via de sinalização da insulina no controle da toxicidade do GO e seus mecanismos moleculares subjacentes. A mutação do gene daf-2, age-1, akt-1 ou akt-2 induziu uma propriedade resistente dos nematóides à toxicidade GO, enquanto a mutação do gene daf-16 levou a uma propriedade suscetível de nematóides à toxicidade GO, sugerindo que a GO pode desregular as funções do receptor DAF-2 / IGF-1, da cascata mediada por quinase mediada por AGE-1, AKT-1 e AKT-2 e pelo fator de transcrição DAF-16 / FOXO. A análise da interação genética sugeriu o envolvimento da cascata de sinalização de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 no controle da toxicidade GO na longevidade. Além disso, a análise da interferência do RNA intestinal (RNAi) demonstrou que a GO reduziu a longevidade afetando as funções da cascata de sinalização do DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 no intestino. O DAF-16 também pode regular a toxicidade do GO na longevidade, funcionando a montante do SOD-3, que codifica um sistema de antioxidação que evita o acúmulo de estresse oxidativo. Portanto, a sinalização intestinal de insulina pode codificar dois mecanismos moleculares diferentes responsáveis ​​pela toxicidade do GO na indução da longevidade encurtada. Nossos resultados destacam o papel fundamental da via de sinalização da insulina no controle da toxicidade do GO em organismos.

Introdução

Os nanomateriais de carbono são uma família de importantes nanomateriais artificiais (ENMs) com muitas propriedades únicas e potenciais aplicações 1, 2 . O óxido de grafeno (GO) é um membro de ENMs de carbono bidimensionais com uma única camada de átomos de carbono sp 2 -bondados 3 . Devido à sua estabilidade química, alto coeficiente de condução térmica, anfipaticidade, grande área de superfície e facilidade de funcionalização, o GO possui grande potencial para uso na liberação de fármacos, bioimagem, engenharia de tecidos e agentes de bioensaio 1, 2 .

Dada a promessa excepcional das aplicações GO, vários estudos com foco na toxicidade do GO foram realizados 4 . Alguns estudos sugeriram citotoxicidade e vários aspectos de efeitos adversos em animais, como toxicidade pulmonar e imunotoxicidade da exposição a GO 4, 5, 6, 7, 8 . Mais recentemente, alguns relatos foram publicados com o objetivo de elucidar ainda mais os mecanismos moleculares da toxicidade do GO 9, 10, 11, 12 . Um estudo demonstrou que a ativação da sinalização Toll-like 4 (TLR4) e a subsequente produção autocrina de TNF-α podem estar envolvidas no controle da toxicidade do GO em macrófagos 10 . Além disso, mRNAs desregulados, proteínas e microRNAs (miRNAs) foram identificados em células HepG2 humanas expostas GO ou células GLC-82 9, 11, 12 .

Caenorhabditis elegans é um modelo animal clássico que oferece um sistema de ensaio para investigar os mecanismos toxicológicos in vivo de substâncias tóxicas, incluindo os ENMs 13 . C. elegans compartilham propriedades conservadas para processos fisiológicos básicos, resposta ao estresse e vias de sinalização molecular com humanos 14 . Usando o C. elegans , estudos prévios sugeriram a toxicidade do GO nas funções dos órgãos-alvo primários (como o intestino) e secundários (como órgãos neuronais e reprodutivos) 15, 16, 17, 18 . Em relação aos mecanismos celulares de toxicidade do GO, os dados publicados sugeriram que a toxicidade do GO pode ser conseqüente à biodisponibilidade, indução de espécies reativas de oxigênio (ROS), permeabilidade intestinal aumentada, resposta imunológica inata interrompida e duração prolongada do ciclo de defecação em nematóides 16, 17, 19, 20 . Estudos anteriores também sugeriram o papel crucial da barreira biológica intestinal contra a toxicidade do GO em nematoides 17, 21 . Também tem sido relatado que a indução do estresse oxidativo pode ter um papel fundamental no mecanismo químico para a longevidade encurtada induzida por GO em nematoides expostos 15 . No entanto, os mecanismos moleculares para a longevidade encurtada induzida pela toxicidade do GO ainda são largamente desconhecidos.

A via de sinalização insulina / fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) tem sido implicada como um mecanismo molecular chave para o controle da longevidade em nematóides 22, 23 . Esta via de sinalização também tem demonstrado desempenhar papéis importantes na regulação de outros importantes processos biológicos, incluindo armazenamento de gordura, imunidade inata e resposta ao estresse 24, 25, 26 . Além disso, mostramos anteriormente que a sinalização de insulina regula a toxicidade de partículas de partículas relacionadas ao tráfego (PM 2.5 ) em C. elegans 26 . Em C. elegans , os ligantes da insulina se ligam ao receptor DAF-2 / IGF-1 (InR), ativam a atividade da tirosina quinase e iniciam a cascata de várias quinases: AGE-1 / fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), PDK-1 / Quinase 1 3-fosfoinositida dependente, AKT-1/2 / serina / treonina quinase Akt / PKB e SGK-1 / serina ou treonina-quinase proteica 23 . A AKT e a SGK-1 também fosforilam e inativam o fator de transcrição DAF-16 / FOXO, bloqueando assim a transcrição de genes-alvo, como o gene sod-3 23, 27, 28, 29, 30 . O DAF-18 / fosfatidilinositol 3, 4, 5-trifosfato 3-fosfatase (PTEN) desfosforila o AGE-1, o que previne a fosforilao do DAF-16 pelas quinases a jusante 23, 27, 29 . O ensaio de atividade específica do tecido demonstrou as importantes funções do DAF-16 na regulação da longevidade no intestino e nos neurônios dos nematoides 30 . Curiosamente, nosso estudo anterior sugeriu que a mutação do gene sod-3 resultou em uma propriedade suscetível de nematódeos à toxicidade do GO ao longo da vida, reprodução e comportamento de locomoção, e induziu uma indução mais severa da produção de ROS em nematóides expostos 19, 21 . No presente estudo, empregamos um sistema de ensaio in vivo de C. elegans para investigar o possível envolvimento da via de sinalização da insulina no controle da toxicidade da GO e seus potenciais mecanismos moleculares. Nossos resultados sugerem que a via de sinalização da insulina pode codificar dois mecanismos moleculares diferentes para o menor tempo de vida induzido pela GO em nematóides. O exame desses mecanismos moleculares da regulação da toxicidade da GO pela via de sinalização da insulina fornece uma importante base para maior elucidação das redes moleculares envolvidas no controle da toxicidade da GO em organismos.

Resultados

Propriedades físico-químicas do GO

A distribuição de tamanho do GO no meio K é mostrada na Fig. S1a. A maior parte do GO no meio K estava na faixa de 40 a 50 nm (Fig. S1a). O tamanho de agregação GO foi de 386 ± 75 nm (Fig. S1a). GO aparecia em forma de folha, com uma espessura de cerca de 1, 0 nm em altura topográfica, o que corresponde a aproximadamente uma camada (Fig. S1b). O potencial zeta do GO (100 mg / L) no meio K foi de -22, 5 ± 1, 7 mV. A medição da espectroscopia Raman demonstrou um sinal de banda D do GO após tratamento com ácido sulfúrico e KMnO 4, indicando uma introdução de desordem na camada de grafite (Fig. S1c). A banda AG e a banda D foram encontradas a 1589 cm -1 e a 1336 cm -1, respectivamente (Fig. S1c).

A exposição GO influenciou os padrões de expressão de genes que codificam a via de sinalização da insulina em nematóides

Entre os genes que codificam a via de sinalização da insulina em C. elegans , a exposição GO (100 mg / L) resultou em um aumento significativo nos níveis de expressão dos genes daf-2, age-1, akt-1 e akt-2 , e uma diminuição nos níveis de expressão dos genes daf-18 e daf-16 em nematóides do tipo selvagem (Fig. 1a). Além disso, considerando o fato de que a via de sinalização da insulina pode regular alguns processos biológicos, como a longevidade, limitando a localização nuclear do DAF-16 29, postulamos que a exposição a GO também pode afetar a localização nuclear do DAF-16 em nematóides. Com o auxílio da linhagem transgênica de zIs356, observamos um aumento significativo na DAF-16: expressão de GFP nos núcleos de nematóides expostos a GO (100 mg / L) em comparação com o controle (Fig. 1b). Assim, a exposição a GO pode não apenas afetar as atividades transcricionais dos genes que codificam a via de sinalização da insulina, mas também influenciar a translocação núcleo-citoplasma do DAF-16 em nematoides.

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( a ) a exposição GO alterou os níveis de expressão de alguns genes que codificam a via de sinalização da insulina em nematóides do tipo selvagem. ( b ) A exposição GO influenciou a translocação do núcleo do DAF-16 :: GFP. Pontas de seta indicam a expressão de DAF-16 no intestino. A concentração de exposição GO foi de 100 mg / l. A exposição prolongada foi realizada a partir de L1-larvas para adultos jovens. Barras representam médias ± SEM. ** P <0, 01 vs. controle.

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Mutação do gene daf-16 induz uma propriedade suscetível de nematóides à toxicidade do GO

Em C. elegans , o gene daf-16 codifica um fator transcricional FOXO, que regula vários processos biológicos afetando as funções de seus genes alvo 23 . Estudos anteriores sugeriram que o comportamento de locomoção é um ponto de extremidade muito sensível para avaliar os efeitos adversos dos ENMs em nematóides 31, 32 . O comportamento de locomoção foi avaliado pela cabeça thrash e curvatura do corpo em nematóides 31, 32 . Após exposição prolongada, descobrimos que a mutação de perda de função do gene daf-16 resultou em uma diminuição mais severa no espessamento da cabeça ou curvatura do corpo nos nemátodes expostos ao GO em comparação com os nematóides do tipo selvagem expostos ao GO (Fig. 2a). Usando o tempo de vida como o ponto final, observamos ainda que os mutantes daf-16 ( mu86 ) expostos ao GO mostraram um tempo de vida mais severamente reduzido em comparação com os nemátodos do tipo selvagem expostos ao GO (Fig. 2b, Tabela S1). Estes resultados sugerem que a mutação do gene daf-16 induz uma maior susceptibilidade à toxicidade da GO em C. elegans .

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( a ) Efeitos da mutação do gene daf-16 ou daf-2 no comportamento de locomoção em nematoides expostos a GO. ( b ) Efeitos da mutação do gene daf-16 ou daf-2 ao longo da vida em nematóides expostos a GO. ( c ) Mutações do gene age-1, akt-1, akt-2 ou daf-18 afetaram a toxicidade do GO no comportamento de locomoção em nematoides. ( d ) Mutaes do gene da idade 1, akt-1, akt-2 ou daf-18 afectaram a toxicidade da GO ao longo da vida em nemodos. O comportamento de locomoção dos nematoides foi avaliado por endpoints de cabeça thrash e curvatura do corpo. A concentração de exposição GO foi de 100 mg / l. A exposição prolongada foi realizada a partir de L1-larvas para adultos jovens. Barras representam médias ± SEM. ** P <0, 01 vs. controle (se não for especialmente indicado).

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Mutação do gene daf-2 induziu uma propriedade resistente de nematóides à toxicidade do GO

Em C. elegans , o gene daf-2 codifica um receptor de insulina, que é responsável por receber sinais dos peptídeos de insulina 23 . Utilizando o comportamento de locomoção como o ponto final, descobrimos que os mutantes daf-2 ( e1370 ) eram resistentes à toxicidade de GO tanto na cabeça como na curva do corpo em comparação com os nematóides do tipo selvagem expostos a GO (Fig. 2a). Além disso, os mutantes daf-2 ( e1370 ) expostos ao GO exibiram um aumento significativo da expectativa de vida em comparação com os nematóides do tipo selvagem expostos ao GO (Fig. 2b, Tabela S1). Portanto, nossos resultados sugerem que a mutação daf-2 ( e1370 ) induz resistência à toxicidade do GO.

Os genes age-1, akt-1, akt-2 ou daf-18 estão envolvidos no controle da toxicidade do GO em nematóides

Em C. elegans , os genes age-1, akt-1 e akt-2 codificam a cascata de quinase entre o DAF-2 e o DAF-16, e o DAF-18 age como um supressor do AGE-1 na insulina. via de sinalização 23 . Usando o comportamento de locomoção e expectativa de vida como os pontos finais, descobrimos que os mutantes idade-1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ) e akt-2 ( ok393 ) eram resistentes à toxicidade GO no comportamento de locomoção ou vida útil (Fig. 2c, d Tabela S2). Em contraste, os mutantes daf-18 ( ok480 ) foram suscetíveis à toxicidade do GO no comportamento de locomoção ou no tempo de vida (Fig. 2c, d, Tabela S2). Esses resultados sugerem que AGE-1, AKT-1 e AKT-2 constituem uma cascata de quinase para a via de sinalização da insulina, que está envolvida no controle da toxicidade do GO em nematoides.

Interações genéticas do gene na via de sinalização da insulina na regulação da toxicidade do GO na longevidade em nematóides

Em seguida, investigamos as interações genéticas do gene daf-16 com outros genes na via de sinalização da insulina na regulação da toxicidade do GO na longevidade em nematóides. Descobrimos que a mutação do gene daf-16 poderia efetivamente reduzir o tempo de vida dos mutantes daf-2 ( e1370 ), idade-1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ) ou akt-2 ( ok393 ) expostos por GO (Fig 3, Tabela S3). Estes resultados implicam que o DAF-16 pode actuar a jusante de DAF-2, AGE-1, AKT-1 e AKT-2 para regular a toxicidade de GO na longevidade em nemátodos.

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A concentração de exposição GO foi de 100 mg / l. A exposição prolongada foi realizada a partir de L1-larvas para adultos jovens.

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Descobrimos ainda que a mutação do gene daf-18 poderia efetivamente reduzir o tempo de vida em mutantes de idade ( hx546 ) expostos ao GO (Fig. 3, Tabela S3), o que confirma o papel supressor do DAF-18 na AGE-1 no controle da toxicidade da GO em nematóides.

Atividade específica de tecido do DAF-16 na regulação da toxicidade do GO em nematóides

Em C. elegans , o gene daf-16 é expresso em quase todos os tecidos, incluindo o intestino, os neurônios, os músculos e a faringe 23 . Usando o comportamento de locomoção e tempo de vida como endpoints, descobrimos que a expressão do gene daf-16 nos neurônios, músculos ou faringe não influenciou significativamente o comportamento de locomoção ou tempo de vida em mutantes daf-16 ( mu86 ) expostos por GO (Fig. 4 Tabela S4). Em contraste, observamos que a expressão do gene daf-16 no intestino efetivamente aumentou a diminuição do comportamento de locomoção ou a redução do tempo de vida dos mutantes daf-16 ( mu96 ) expostos pela GO (Fig. 4, Tabela S4). Estes resultados sugerem que o gene daf-16 pode atuar principalmente no intestino para regular a toxicidade do GO em nematoides.

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( a ) Atividade específica do tecido do DAF-16 na regulação da toxicidade do GO no comportamento de locomoção em nematoides. O comportamento de locomoção dos nematoides foi avaliado por endpoints de cabeça thrash e curvatura do corpo. ( b ) Atividade específica de tecido do DAF-16 na regulação da toxicidade do GO ao longo da vida em nematóides. A concentração de exposição GO foi de 100 mg / l. A exposição prolongada foi realizada a partir de L1-larvas para adultos jovens. Barras representam médias ± SEM. ** P <0, 01 vs. tipo selvagem.

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A interferência de RNA específica do intestino (RNAi) dos genes que codificam a via de sinalização da insulina afetou a toxicidade do GO na longevidade em nematóides

Para examinar mais detalhadamente a atividade tecidual de outros genes na via de sinalização da insulina na regulação da toxicidade do GO, realizamos RNAi específico do intestino na linhagem VP303 33 . Em nematóides, descobrimos que o RNAi específico do intestino do gene daf-2, age-1, akt-1 ou akt-2 resultou em vida útil prolongada, enquanto RNAi específico do intestino do gene daf-16 ou daf-18 levou para reduzir o tempo de vida (Fig. 5, Tabela S5). Além disso, após exposição prolongada, foi observada uma propriedade resistente à toxicidade de GO em nematoides com o RNAi específico de intestino do gene daf-2, age-1, akt-1 ou akt-2 , enquanto uma propriedade suscetível à toxicidade de GO foi observado em nemátodos sujeitos a RNAi específico de intestino do gene daf-16 ou daf-18 (Fig. 5, Tabela S5). Esses resultados sugerem que a via de sinalização da insulina pode atuar no intestino para regular a toxicidade do GO em nematoides. Como a cepa VP303 apresenta déficits no comportamento de locomoção, não examinamos os efeitos de RNAi específicos de intestino de genes que codificam a via de sinalização de insulina no comportamento de locomoção em nematóides expostos a GO.

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A concentração de exposição GO foi de 100 mg / l. A exposição prolongada foi realizada a partir de L1-larvas para adultos jovens.

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Regulação da toxicidade do GO pelo alvo DAF-16 SOD-3

Em C. elegans, o sod-3 é um importante gene alvo do gene daf-16 e codifica uma superóxido dismutase mitocondrial de ferro / manganês necessária para a defesa contra o estresse oxidativo 23 . A SOD-3 é expressa na faringe na cabeça, intestino, músculo, vulva e cauda 34 . Em geral, a expressão fraca de SOD-3 é esperada no intestino 34 . Após exposição prolongada, entretanto, observamos que o GO poderia aumentar significativamente a expressão de SOD-3 no intestino de nematoides em comparação com o controle (Fig. 6a).

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( a ) Efeitos da exposição GO na expressão SOD-3 :: GFP. A esquerda mostra imagens para expressão de SOD-3 :: GFP, e a direita mostra comparação de intestino de fluorescência relativa de SOD-3 :: GFP no intestino de nematóides. Os asteriscos indicam o intestino dos nematóides. ( b ) Efeitos de RNAi específico de intestino do gene sod-3 ao longo da vida em nemátodes expostos a GO. ( c ) Efeitos da superexpressão intestinal do gene daf-16 na toxicidade do GO ao longo da vida em nematóides. ( d ) Efeitos da mutação de sod-3 ao longo da vida em nemátodes expostos ao GO, sobre - expressando o gene daf-16 no intestino em nematóides. A concentração de exposição GO foi de 100 mg / l. A exposição prolongada foi realizada a partir de L1-larvas para adultos jovens. Barras representam médias ± SEM. ** P <0, 01 vs. tipo selvagem.

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Usando o VP303 como ferramenta de RNAi intestinal, descobrimos que o RNAi intestinal do gene sod-3 induz uma propriedade suscetível de nematóides à toxicidade GO na longevidade em nematóides (Fig. 6b, Tabela S6). O RNAi intestinal do gene sod-3 , no entanto, não afetou o tempo de vida dos nematoides na ausência da exposição GO (Fig. 6b, Tabela S6). Portanto, a SOD-3 também pode ser capaz de agir no intestino para regular a toxicidade do GO na longevidade em nematóides.

Interação genética entre DAF-16 e SOD-3 na regulação da toxicidade do GO na longevidade de nematóides

Para examinar melhor a interação entre o gene daf-16 e o gene sod-3 na regulação da toxicidade do GO, construímos a linhagem transgênica de Ex ( Pges-1-daf-16 ), na qual o gene daf-16 foi superexpresso intestino de nemátodos. A superexpressão intestinal do gene daf-16 induziu uma propriedade resistente dos animais à toxicidade da GO na longevidade (Fig. 6c, Tabela S7). Em contraste, observamos que a propriedade resistente da linhagem transgênica de Ex ( Pges-1-daf-16 ) à toxicidade de GO na longevidade pode ser visivelmente inibida pela mutação de sod-3 em nematóides (Fig. 6d, Tabela S7). Em condições normais, o mutante sod-2 ( gk235 ) teve vida útil semelhante à do N2 selvagem, enquanto a mutação do gene sod-2 não afetou obviamente o fenótipo de vida longa dos nematóides que superexpressam o gene daf-16 no intestino (Fig. S2, Tabela S7). Estes resultados sugerem que o DAF-16 pode ainda funcionar a montante da SOD-3 para regular a toxicidade do GO na longevidade em nematóides.

Interação genética entre DAF-16 e SOD-3 na regulação da toxicidade do GO na indução da produção de ROS

Finalmente, investigamos a interação entre DAF-16 e SOD-3 na regulação da toxicidade do GO na indução da produção intestinal de EROs em nematoides. A mutação do gene sod-3 ou a superexpressão do gene daf-16 no intestino não induziu produção significativa de EROs em nematoides na ausência de exposição a GO (Fig. S3). No entanto, após a exposição ao GO, observamos que a superexpressão do gene daf-16 no intestino suprimiu significativamente a indução da produção intestinal de EROs em nematóides (Fig. S3). Em contraste, após a exposição a GO, a mutação do gene sod-3 fortaleceu a indução da produção intestinal de EROs em nematóides (Fig. S3). Além disso, após exposição a GO, a mutação do gene sod-3 induziu indução significativa da produção intestinal de EROs em nematóides superexpressando o gene daf-16 no intestino (Fig. S3).

Discussão

Estudos anteriores sugeriram que a via de sinalização da insulina está envolvida no controle de processos biológicos, como a imunidade inata e a resposta ao estresse em nematoides 25, 26 . No presente estudo, nós fornecemos evidências para apoiar o envolvimento da via de sinalização da insulina no controle da toxicidade de ENMs específicos, como o GO. Em nematóides, a exposição GO na concentração de 100 mg / L aumentou os níveis de expressão dos genes daf-2, age-1, akt-1 e akt-2 , enquanto diminuiu os níveis de expressão da daf-18 e daf- 16 genes (Fig. 1a). Estes resultados implicam que, pelo menos na concentração examinada, a exposição GO pode desregular as funções do receptor DAF-2 / IGF-1, da cascata mediada por quinase mediada por AGE-1, AKT-1 e AKT-2, e DAF-16 / FOXO fator de transcrição (Fig. 7). Mais interessante, nós também descobrimos que GO é capaz de afetar a função de AGE-1 através da regulação negativa da expressão de DAF-18 em nematóides (Fig. 7).

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Evidências dos mutantes genéticos confirmaram ainda os papéis de DAF-2, AGE-1, AKT-1, AKT-2, DAF-18 e DAF-16 na regulação da toxicidade do GO. A mutação do gene daf-2, age-1, akt-1 ou akt-2 induziu uma propriedade resistente dos nematóides à toxicidade do GO; no entanto, a mutação do gene daf-18 ou daf-16 induziu uma propriedade suscetível dos nematóides à toxicidade do GO (Fig. 2, Tabela S1 e S2). Em C. elegans, foi relatado que os mutantes daf-2, age-1, akt-1 e akt-2 eram resistentes à infecção de Pseudomonas aeruginosa ; no entanto, o mutante daf-18 ou daf-16 infectado por P. aeruginosa apresentou vida útil semelhante à dos nematóides do tipo selvagem infectados por P. aeruginosa 25 . Foi ainda relatado que o PM 2.5 aumentou significativamente os níveis de expressão dos genes daf-2 e akt-1 , enquanto diminuiu os níveis de expressão dos genes daf-18 e daf-16 26 . Estes resultados implicam que a via de sinalização da insulina pode regular diferentes processos biológicos através de diferentes cascatas de sinalização em nematóides.

A análise da interação genética sugeriu que a cascata de sinalização básica de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 poderia desempenhar um papel no controle da toxicidade de GO na longevidade em nematóides (Figs. 3 e 7, Tabela S3). . A cascata de sinalização de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 também tem se mostrado envolvida no controle da resposta imune de nematóides no contexto da infecção por P. aeruginosa 25 . Estes resultados sugerem que o DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 pode ser uma cascata de sinalização conservada para a via de sinalização da insulina na regulação de eventos biológicos associados à imunidade inata, resposta ao estresse e nanotoxicidade em nematóides.

Estudos prévios sugeriram que a expressão intestinal de DAF-16 é amplamente responsável por sua função na regulação da longevidade em nematoides 22, 23, 30 . No entanto, a atividade específica do tecido do DAF-16 na regulação da resposta ao estresse ou nanotoxicidade permanece incerta. Além disso, estudos prévios demonstraram que a sinalização da insulina está envolvida no controle da toxicidade do PM 2.5 no desenvolvimento e função do intestino em nematoides 26 . Neste estudo, descobrimos que a atividade específica do intestino de DAF-16 foi necessária para a sua função na regulação da toxicidade do GO na longevidade em nematóides (Fig. 4, Tabela S4). Curiosamente, observamos que o RNAi intestinal de genes que codificam a cascata de sinalização de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 também afetou a toxicidade GO na longevidade em nematóides (Fig. 5, Tabela S5). Estes resultados implicam que a exposição a GO pode reduzir a longevidade desregulando as funções da cascata de sinalização de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16, uma cascata de sinalização conservada necessária para o controle da longevidade, no intestino de nematóides 22 23 . Em outras palavras, a sinalização intestinal de insulina provavelmente está envolvida na regulação da toxicidade do GO na longevidade em nematóides. Nossa hipótese é que a sinalização alterada de insulina pode ser um dos mecanismos moleculares da toxicidade da GO na longevidade em nematóides (Fig. 7).

Neste estudo, descobrimos que a sinalização da insulina poderia contribuir potencialmente para outro mecanismo molecular para a toxicidade do GO na longevidade. Nossos resultados sugerem que o DAF-16 funcionou a montante da SOD-3 para regular a toxicidade do GO na longevidade (Fig. 6d, Tabela S7). Em nematóides, o gene sod-3 codifica o sistema de antioxidação contra a indução do estresse oxidativo. Nos nemátodes expostos a GO, a função da SOD-3 contra o stress oxidativo foi confirmada pelo ensaio de produção de ROS no mutante sod-3 (Fig. S3). Curiosamente, descobrimos que a mutação do gene sod-3 poderia induzir ainda mais a indução significativa da produção de ROS em nematóides expostos ao GO, superexpressando o gene daf-16 no intestino (Fig. S3). Estes resultados implicam que a exposição a GO também pode reduzir a longevidade, afetando as funções do sistema de antioxidação contra a indução do estresse oxidativo. Nossa hipótese é que este é outro mecanismo molecular para a toxicidade da GO na longevidade, que é dependente da sinalização da insulina e seu importante gene - alvo sod-3 em nematóides (Fig. 7). Esse mecanismo proposto também fornece base para o papel do estresse oxidativo na indução da toxicidade do GO em nematoides, como descrito anteriormente em outros relatos 15 .

Em C. elegans , o DAF-16 atua como um fator de transcrição para ativar a atividade de seus genes-alvo quando o DAF-16 é translocado para o núcleo 22, 23 . Curiosamente, observamos que, juntamente com a expressão severamente diminuída de DAF-16, verificou-se que certa quantidade de DAF-16 foi translocada para o núcleo (Fig. 1b). Estes resultados implicam que pelo menos uma certa quantidade de DAF-16 translocado para o núcleo também pode induzir um circuito de retroalimentação positiva entre o DAF-16 e outros componentes da via de sinalização em nematóides.

Em conclusão, investigamos o envolvimento da via de sinalização da insulina no controle da toxicidade da GO na longevidade e os mecanismos subjacentes em nematóides. Identificamos uma cascata de sinalização do DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 na via de sinalização da insulina que está envolvida no controle da toxicidade do GO na longevidade. Além disso, descobrimos que essa cascata de sinalização agia primariamente no intestino para regular a toxicidade da GO na longevidade. Com base em nossos resultados, hipotetizamos que um dos mecanismos moleculares para a toxicidade do GO é que o GO poderia desregular a cascata de sinalização do DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 na via de sinalização da insulina. Além disso, descobrimos que a via de sinalização da insulina poderia codificar outro mecanismo molecular para a redução da longevidade induzida pela GO. A exposição GO poderia suprimir a função do DAF-16 na sinalização da insulina e, assim, levar a uma inibição adicional da função da SOD-3, que desempenha um papel importante na defesa contra o estresse oxidativo em nematóides expostos a GO. Os mecanismos moleculares elucidados de sinalização de insulina codificados para a redução da longevidade induzida pela GO destacam o papel potencial da via de sinalização da insulina no controle da toxicidade da GO em organismos.

Métodos

Reagentes e preparação de GO

GO foi preparado a partir do pó de grafite natural usando um método de Hummer modificado 35, 36 . Grafite (2 g) e nitrato de sódio (1 g) foram adicionados a um frasco de 250 mL. Após adição de H2SO4 concentrado (50 mL) em gelo, adicionou-se KMnO4 (7 g) à mistura. E então, 90 mL de H2O foram gotejados lentamente na pasta após a temperatura da mistura ser aquecida a 35 ° C. Depois de agitar a suspens dilua a 70 durante mais 15 min, a suspens foi tratada com a mistura de 7 mL de H 2 O 2 a 30% e 55 mL de H 2 O. A suspens morna resultante foi filtrada para obter um filtro amarelo-castanho bolo, que foi depois lavado com uma soluo de HCl a 3%, seguido por secagem a 40 durante 24 h. GO foi obtido por ultrassonicação de óxido de grafite em água por 1h.

GO foi sonicado por 30 min (40 kHz, 100 W) e disperso em meio K para preparar uma solução estoque (1 mg / L). A solução stock foi diluída para a concentração utilizada (100 mg / l) com meio K imediatamente antes da exposição. Estudos prévios sugeriram que a GO na concentração de 100 mg / L poderia diminuir a longevidade em nematoides 16 . Todos os outros produtos químicos foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

Caracterização do GO

O GO foi caracterizado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, JEM-200CX, JEOL, Japão), microscopia de força atômica (AFM, SPM-9600, Shimadzu, Japão), espectroscopia Raman utilizando excitação de comprimento de onda de 632nm (Renishaw Invia Plus, UK) e potencial zeta analisados ​​pelo Nano Zetasizer usando uma técnica de espalhamento de luz dinâmico. Para realizar a medição de AFM, pipetou-se suspensão GO sobre substratos de Si e os substratos de Si foram ainda mais secos ao ar e colocados sob a ponta de AFM.

Preparação da cepa C. elegans

Os nematóides foram mantidos em placas de meio de crescimento de nematóides (NGM) semeados com Escherichia coli OP50 a 20 ° C, como descrito anteriormente 37 . Os nematoides utilizados no presente estudo eram do tipo selvagem N2, mutantes de daf-16 ( mu86 ), daf-2 ( e1370 ), idade-1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ), akt-2 ( ok393 ), daf -18 ( ok480 ), sod-3 ( gk235 ), daf-16 ( mu86 ); sod-3 ( gk235 ) e daf-16- ( mu86 ); daf-2 ( e1370 ) e cepas transgênicas de VP303 / kbIs7 [ nhx-2p :: rde-1 ], zIs356 [P daf-16 :: daf-16a / b: GFP ], daf-16 ( mu86 ) Ex (P ges-1-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P -14-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P mio-3-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P myo-2-daf-16 ), Ex ( Pges-1-daf-16 ) e Ex ( Pges-1-daf-16 ); sod-3 ( gk235 ). Algumas das cepas usadas foram originalmente obtidas do Caenorhabditis Genetics Centre (financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)). Os nemátodos grávidos foram lavados das placas para tubos de centrifugação, e lisados ​​com uma mistura de branqueamento (NaOH a 0, 45 M, HOCl a 2%). Populações síncronas de idade de larvas L1 foram preparadas como descrito anteriormente 38 . A exposição prolongada ao GO foi realizada a partir de L1-larvas para adultos jovens em placas de cultura de tecidos estéreis de 12 poços a 20 ° C na presença de alimentos (OP50). Os nematóides expostos foram utilizados para avaliação de toxicidade usando vida útil, comportamento de locomoção e produção de ROS como endpoints.

Transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

Os RNAs totais foram extraídos usando o kit RNeasy Mini (Qiagen) e, em seguida, transcritos reversamente usando o kit de reagentes PrimeScript TM RT (Takara, Otsu, Shiga, Japão). Após a síntese de cDNA, a PCR em tempo real foi realizada usando SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara) para amplificação de produtos de PCR. A transcrição reversa quantitativa por PCR foi realizada à temperatura de recozimento optimizada de 58 ° C. A quantificação relativa dos genes alvo em comparação com o gene tba-1 de referência que codifica uma proteína tubulina foi determinada. Os resultados finais foram expressos como a relação de expressão relativa entre o gene alvo e o gene de referência. Os primers projetados para genes direcionados e o gene tba-1 de referência foram mostrados na Tabela S8. Todas as reações foram realizadas em triplicado.

Ensaio de translocação nuclear DAF-16

A translocação nuclear de DAF-16 foi pontuada após exposição à estirpe transgénica de zIs356 a GO. DAF-16 intestinal :: GFP foi classificado como localização nuclear na parte anterior do corpo. As imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência Zeiss Imager A2. Três experimentos independentes com dez nematóides por tratamento foram examinados.

Avaliação de toxicidade

O ensaio de vida útil foi realizado a 20 ° C, basicamente como descrito 39 . Os nematóides hermafroditas foram transferidos diariamente durante os primeiros 4 dias da idade adulta. Depois disso, os nematóides foram verificados todos os dias. Nematóides seriam marcados como mortos se eles não se movessem mesmo após repetidos toques com uma palheta. Quarenta nematóides foram examinados por tratamento, e três repetições foram realizadas.

O comportamento de locomoção dos nematóides foi avaliado pelos desfechos de cabeça e curvatura do corpo, conforme descrito 40 . Um thrash de cabeça foi definido como uma mudança na direção de flexão no meio do corpo. Uma curvatura do corpo foi contada como uma mudança na direção da parte dos nematóides correspondentes ao bulbo posterior da faringe ao longo do eixo y , assumindo que o nematóide estava viajando ao longo do eixo x . Vinte nematóides foram examinados por tratamento, e dez repetições foram realizadas.

O método para produção de ROS foi realizado conforme descrito anteriormente 41 . Após a exposição, os nematóides foram transferidos para 1 μM de diacetato de 5 ', 6' -clorometil-2 ', 7' -diclorodi-hidrofluorescina (CM-H2DCFDA; Molecular Probes) em placas de cultura de tecidos estéreis de 12 poços para incubar por 3 ha 20 ° C no escuro sem adição de alimentos. Os nemátodos foram montados em almofadas de agar a 2% para exame a 488 nm de comprimento de onda de excitação e 510 nm de filtro de emissão com um microscópio confocal de varrimento a laser (Leica, TCS SP2, Bensheim, Alemanha). A intensidade relativa de fluorescência do intestino foi semi-quantificada. ROS semiquantificadas foram expressas como unidades de fluorescência relativa (RFU) e normalizadas para autofluorescência. Trinta nematoides foram examinados por tratamento e cinco repetições foram realizadas.

RNAi

O RNAi foi realizado alimentando nematódeos com a linhagem HT115 (DE3) de E. coli expressando RNA de cadeia dupla que é homólogo a um gene alvo como descrito 42 . E.coli HT115 (DE3) crescido em caldo LB contendo ampicilina (100 mg / mL) a 37 ° C durante a noite foi plaqueado em NGM contendo ampicilina (100 mg / mL) e 1-tio-p-D-galactopiranósido isopropílico (IPTG, 5 mM). Larvas L2 foram colocadas em placas de RNAi por 2 dias a 20 ° C até que os nematóides se tornassem grávidos. Os adultos grávidas foram transferidos para gramados bacterianos frescos que expressam RNAi para pôr ovos durante 2 h, de modo a obter a segunda geração de população de RNAi. Os ovos foram deixados a desenvolver a 20 ° C para adultos jovens para os ensaios subsequentes.

Construções de DNA e transformação germinal

Para gerar uma sequência promotora portadora do vetor de entrada, regiões promotoras para o gene ges-1 especialmente expresso no intestino, o gene unc-14 especialmente expresso em neurônios, o gene myo-3 especialmente expresso no músculo e o gene mio-2 especialmente expresso na faringe foram amplificados por PCR a partir de ADN genómico de C. elegans do tipo selvagem. Os fragmentos do promotor foram inseridos no vector pPD95_77 na orientação de sentido. O cDNA de daf-16 foi amplificado por PCR e inserido no vector de entrada correspondente contendo a sequcia promotora ges-1, unc-14, myo-3 ou myo-2 . A transformação da linhagem germinativa foi realizada conforme descrito por meio da co-injeção do DNA de teste em uma concentração de 10-40 μg / mL e o DNA do marcador de P -44 :: gfp ou unc-119 (+) na concentração de 60 μg / mL no gônadas de nematóides 43 .

Análise estatística

Todos os dados deste artigo foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Os gráficos foram gerados usando o Microsoft Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA). A análise estatística foi realizada no SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, EUA). As diferenças entre os grupos foram determinadas usando análise de variância (ANOVA). Os níveis de probabilidade de 0, 05 e 0, 01 foram considerados estatisticamente significativos.

informação adicional

Como citar este artigo : Zhao, Y. et al . A sinalização intestinal da insulina codifica dois mecanismos moleculares diferentes para a longevidade encurtada induzida pelo óxido de grafeno em Caenorhabditis elegans. Sci. Rep. 6, 24024; doi: 10.1038 / srep24024 (2016).

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